James Marsters est le deuxième enfant d'une famille de trois. Passionné de théâtre depuis son plus jeune âge, il fait ses études à la Davis High School à Modesto, en Californie, puis entre au Pacific Conservatory of the Performing Arts de Santa Monica (une école d'arts).

 

En 1982, il intègre la prestigieuse Juilliard School de New York mais se fait renvoyer. Il part pour Chicago et joue dans plusieurs pièces de théâtre, débutant de façon professionnelle dans La Tempête de William Shakespeare en 1987. Il fonde avec d'autres comédiens la compagnie New Mercury Theatre et s'établit ensuite à Seattle en 1990. Il obtient son premier rôle à la télévision en 1992 dans la sérieBienvenue en Alaska. Il revient en Californie en 1997.

 

C'est en interprétant le rôle du vampire Spike, dans la série télévisée Buffy contre les vampires de 1998 à 2003 que James Marsters accède à la notoriété internationale. Son personnage, initialement prévu pour seulement quelques épisodes, devient rapidement populaire auprès du public et il est crédité au générique de la série de la saison 4 jusqu'à la septième et dernière saison. Il reprend ensuite son rôle dans la série dérivée Angel dans tous les épisodes de la cinquième et dernière saison (2003-2004).

 

Par la suite, James Marsters multiplie les apparitions dans des séries, essentiellement de science-fiction, et notamment dans 14 épisodes de Smallville, entre 2005 et 2010, dans Torchwood et dans Caprica.

 

En 2007, il interprète un second rôle dans P.S. I Love You et prête sa voix à Lex Luthor dans le film d'animation Superman: Doomsday.

 

En 2009, il joue le rôle de Piccolo dans Dragonball Evolution.

James Marsters est aussi un auteur-interprète : il est d'abord le leader du groupe Ghost of the Robot, dont l'album Mad Brilliant sort en 2003.

 

En octobre 2004, quelques mois après la séparation du groupe, il commence à se produire en solo. Après un premier album solo, Civilized Man, sorti en avril 2005, il remet cela avec un second album Like A Waterfall sorti en octobre 2007 et disponible sur son site officiel. En 2010, le groupe Ghost of the Robot est reformé et le deuxième album du groupe, Murphy's Law, sort en décembre 2011.

 

Il s'est marié en 1989 avec Liane Davidson, avec qui il a un fils, Sullivan, né en 1996. Le couple a divorcé en 1997. Il se remarie le 14 janvier 2011 avec Patricia Rahman à Los Angeles lors d'une cérémonie civile.